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山羊先进繁殖技术
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      不论技术产生的年代和技术的成熟程度及运用时间的长短,下列的技术都应该归类为先进的山羊繁殖技术:同期发情、人工授精、超数排卵和胚胎移植(MOET)、腹腔镜活体采卵(LOPU)及胚胎的试管或体外生产技(IVP)、转基因和克隆技术。
       上述先进繁殖技术的运用使山羊的遗传进展加快。其中的有些技术(如人工授精和胚胎移植)是通过选择差的加大而使遗伟进展加快,而另外一些技术,如母羔的试管胚胎技术(JIVT)是通过缩短世代间隔而使遗传进展加快。这些先进的繁殖技术使高价值山羊个休较之在自然繁殖情况下产生更多的后代。而其中有些技术与同期发情技术相结合,使山羊这种季节性繁殖动物能够在一年中的任何时候都能产羔和泌乳。
   人工授精是运用最广泛的先进繁殖技术,这种技术对全世界家畜的遗传改进作出了最为显著的贡献。人工授精技术结合适当的公畜评定方法(后裔测定),为高价值基因的传播提供了相对简单而廉价的方法。冷冻精液的运用使遗传材料的国际交换更为容易,并使精液在繁殖季节和非繁殖季节都能使用,还延长了高价值公羊的有效繁殖生命(死后也能使用)。
      人工授精和同期发情是山羊生产管理中的关键技术,使配种和分娩时间集中,能在一年中的预定时间销售肉和奶,这有利于销售策略的制定和用于其它目的。
        超数排卵和胚胎移植技术是针对母畜的,而人工授精是针对公畜的,也就是说这种技术使高遗传价值的母羊较之在自然繁殖的情况下生产更多的后代。虽然这种说法在理论上是正确的,但由于各式各样原因,例如成本、技术要求和该技术效率的不稳定性和不可预知性,使MOET还不可能成为遗传改进的常用手段。
        腹腔镜活体采卵结合胚胎的试管生产能够使高遗传价值的母山羊生产更多的后代。这种技术较之手术胚胎回收技术的手术创伤小,因而在母山羊的繁殖生命中可多次重复使用该技术,而且这种技术的可预知性要好于超数排卵技术。
    如果转基因和体细胞核转移(SCNT)技术的效率更高并且成本不太昂贵,就能够在加快或促进遗传进展上发挥重要作用。目前该技术在山羊中的应用主要是为了产生和繁殖这样的转基因山羊,其山羊奶中含有高价值重组药物蛋白。
        现将上述先进技术分别介绍如下:
        1 同期发情
        同期发情是对母羊群用外源性激素进行处理,或通过改变管理措施,使之发情相对集中在一定时间范围内的技术,亦称发情周期化。同期发情是组成先进繁殖技术综合方案的关键部分,对方案总的效率产生重要影响。由于山羊是季节性繁殖动物,因而在非繁殖季节实施人工授精、超数排卵和腹腔镜活体采卵等技术时,同期发情具有重要的作用。同期发情技术的运用有利于山羊人工授精的推广和山羊的品种改良,便于山羊生产的组织和管理及降低配种费用。
        山羊同期发情技术中使用最为广泛的方法是用孕酮或孕激素处理9~11天,然后在阴道海绵栓取出前48小时用前列腺素(或类似物)进行溶黄体处理。根据激素处理的有效部位,孕酮或孕激素的处理可通过阴道海绵栓、CIDRA(新西兰制造,是以尼龙为芯,外面为医用弹性硅酮制成,并浸润有天然孕酮)或皮下埋植的方法进行。
        为了人工授精,也是为了胚胎移植受体的同期发情,在取出阴道海绵前48小时,用250~500IU的马绒毛膜促性腺激素(eCG)(溶黄体制剂)进行处理。eCG能够促进卵泡的发育和同期排卵,使人工授精和胚胎移植在预定的时间进行。eCG的使用剂量应根据季节、品种、体重、年龄、期望的产羔数和个体在以前对这种药物的响应进行调整。
        有报导表明,反复使用eCG导致在通常确定的人工授精时间造成受胎率下降。其原因是由于以前的处理所产生的抗eCG的抗体存在造成的。这种抗体的存在显然与发情出现时间的延迟有关,同期发情母羊的LH峰值和排卵时间就说明了受胎率低的原因。
        采用孕激素长时间处理的方案(18~21天)时,并不需要使用溶黄体药物,但会导致受胎率下降,这可能是由于精子在生殖道的通过速度减慢造成的。
        Rubianes et al. (2003)提出使用“短时间诱导同期发情方案”,即山羊用孕激素处理5天,在阴道海绵栓或CIDR撤出时用eCG200~300IU进行处理。他认为孕激素的处理超过5天会使大量的大卵泡过度生长和存在,从而降低人工授精的受胎率。他所提出的“短时间诱导同期发情方案”结合eCG处理,并在撤出阴道海绵栓54小时进行鲜精的人工授精,使受胎率达到68%。
        在发情时给予促性腺释放激素(GnRH)可以使排卵的同步性更好一些(Pierson et al., 2003)。这种方法可以提高人工授精的受胎率,也有利于在特定的发育阶段采集转基因和体细胞核转移的卵母细胞和核显微注射的受精卵。
        2 人工授精
        人工授精是最早运用的先进繁殖技术,它对家畜的遗传改进做出了最大的贡献,因为它对于识别和运用高遗传价值的公畜提供了最好的方法。精液的三种保存方法(新鲜精液、低温精液和冷冻精液)和授精的三种技术(阴道、子宫颈和子宫内)已经在山羊这种动物广泛应用。
        当公羊本身就在羊群中时,特别是当繁殖季节中,精液的产量和品质都处于最佳状态时,新鲜精液的就是首选的保存方法。当范围不大的地区有许多养羊户共同使用一只公羊时,通常就采用低温精液的保存方法。在这种情况下,精液可在4度左右保存,保存时间为24小时(从采精时计算)。冷冻精液是长期保存方法,它可以一年到头在非常广阔的地区使用,在公羊死后它的遗传物质仍然能够保存下来。
        在20世纪40~50年代就已经实现了牛精液的冷冻保存。在这之后,一直摸仿牛冷冻精液的制作方式进行山羊精液的冷冻,但效果不好。早在50年代就发现山羊尿道球腺的分泌物含有卵黄凝集酶。在有钙元素的情况下,它将卵黄的卵磷脂水解成脂肪酸和溶血卵磷脂。当山羊精液的的缓冲液中含有卵黄时,会释放出大量的溶血卵磷脂,它对山羊精子有很大的毒害作用,因而山羊精液的冷冻技术是很复杂的。有人建议山羊精液在冷冻保存前冼涤两次以除去对精子活力和呼吸有害的外源性底物。这种冼去精清的技术提高了冷冻前后试管中精子的存活率,从而提高了山羊冷冻精液的受精率。但是使用不需要冼去精清的稀释液,可以使山羊冷冻精液的制作过程简单一些。近来已经开发出不含生物成分的稀释液,它能提高山羊精液处理的卫生安全性(Hinsch et al., 1997; Gil et al., 2003)。虽然这类稀释液最初是从牛的稀释液开发出来的,但是H. Baldassarre等人在山羊精液冷冻中使用了法国的Bioexcell产品,结果表明在山羊精液稀释前不需要对其进行离心冼涤处理。
        一般来说,精液保存的方法就指出了人工授精的首选方法。精子在保存过程中受到的伤害越大,那么输精的位置就要越深,才能达到好的受胎率。新鲜精液在阴道内输精是成功的,而对于冷却精液和冷冻精液则需要进行子宫颈内输精。可是为了达到高的受胎率(高于70%),冷冻精液需要进行子宫内输精。对于许多成年母山羊可以通过子宫颈将精液输入子宫内,而对于青年母山羊及某些成年母山羊个体,就只能够使用腹腔镜技术才能达此目的,这就使输精技术变得更为复杂。
        Maxwell等人(1999)证实,解冻精液在精清中的再悬浮可提高绵羊子宫颈输精的受胎率。这种方法在山羊的运用还未达到类似的结果,这有待进一步进行试验。
        人工授精中利用性别精子可增加山羊的繁殖效率,特别对于奶山羊更是如此,因为生产的公羔没有大的商业价值。性别精子的利用在一些畜种都获得成功,如牛(Seidel et al., 1999),马(Buchanan et al., 2000),猪(Rath et al., 2003)和绵羊(Hollinshead et al., 2002)。但是在山羊还未获得成功。预计这种技术今后也能运用于山羊。。
        3 超数排卵和胚胎移植
        人类研究超数排卵和胚胎移植(MOET)已有100余年历史,然而,对畜牧业产生影响是在20世纪70年代以后,牛的MOET首先在北美迅速发展,以后在全世界得到广泛应用。山羊MOET的首次商业化应用是在1973年,当时的新西兰为了建立本国的安哥拉山羊群而采用了胚胎移植技术。之后,澳大利亚安哥拉山羊群的迅速扩繁,美国、澳大利亚、新西兰、德国等国波尔山羊群的建立和扩大,都是利用MOET技术实现的。Holm(1990)用乙二醇作为防冻剂,将丹麦的270枚安哥拉山羊冷冻胚胎运到新西兰移植,获得54%的胚胎成活率。McKlvey等人(1992年)也用乙二醇作为防冻剂,将俄罗斯的绒山羊冷冻胚胎运到苏格兰移植,获得53%的胚胎成活率和67%的受胎率。
        实践表明,MOET是所有先进繁殖技术中最让人困惑的技术,因为MOET的结果有很大的变异性。在标准操作程序没有变化的情况下,其结果可以从完全失败到完全成功之间变化。造成这种技术不可预知性的主要原因是:超数排卵响应的变异性,与超数排卵高响应有关的低受精率,黄体的早期退化。这种不可预知的结果,加之胚胎收集和移植的高成本和需要外科手术,就阻止了MOET在山羊改良中的大规模运用。
        在成功的MOET操作中,平均每只供体母羊可得到6~8枚可移植胚胎。可是,上述结果因为很多因素(如品种、年龄和营养)而有很大的变异性。每只供体母羊的可移植胚胎数的变化范围为0~30枚,有25%~50%供体母羊的可移植胚胎因受精失败和黄体的早期退化而移植失败。
        超数排卵响应的变异性反映出在开始用促性腺激素处理时,存在不受标准超数排卵方案控制的卵泡群(Gonzalez-Bulnes et al., 2003)。这表明可采用一些办法在FSH处理时避免存在大卵泡和增加新的小卵泡。其中的办法包括使用促性腺激素释放激素(GnRH),以及在诱导发情后马上使用促卵泡素(FSH)。超数排卵处理前一周用澳大利亚的Buserelin埋植物进行预处理并不能提高卵母细胞和胚胎供体的响应(Baldassarre et al.,2001)。很可能GnRH预处理需要超过一周的时间才能抵消垂体促性腺激素的影响,使卵巢产生大量的小卵泡。在超数排卵处理前用Antarelix(GnRH拮抗剂)进行10天预处理,结果在用FSH处理时增加了小卵泡的数量和排卵数(Cognié et al., 2003)。可是,这种超数排卵响应的改进并没有产生大量可移植胚胎,其原因是受精率低(大于30%)。近来又有人提出“零天方案”来避免大卵泡的有害影响,并提高超排效果(Menchaca et al.2002)。这种方案是基于在排卵后马上用FSH进行处理,使超排后的黄体数增加30%,但是这个方案只对少数的母羊进行过试验。而且还没有报导回收胚胎的数量和质量。
        受精率低的部分原因是同期发情后精子在生殖道的输送能力下降(Evans and Armstrong, 1984),以及输精和排卵的时间不吻合。上述第一个问题可通过子宫内(腹腔镜)输精予以解决。第二个问题的解决是在发情和人工授精时通过GnRH处理来改进同期排卵,这在前面已述及。Baril et al. (1996)对超排母羊的同期排卵进行了改进,即在取出阴道栓后12小时给予GnRH拮抗剂,在24小时后给予促黄体素(LH)。在同批处理的母羊供体中有30%的个体可能出现黄体早期退化(Pintado et al.,1998)。如果利用腹腔镜在手术前评定超排响应,当出现明显的黄体早期退化时,就不应进行冲卵。因为在大多数情况下,回收的几乎都是未受精的或者退化的卵。黄体早期退化的原因还不完全了解。但是黄体早期退化与营养缺乏、马绒毛膜促性腺激素的超排和应激等因素有关。Battye et al. (1988)证实,前列腺素涉及到黄体的早期溶解,建议在排卵和回收胚胎之间的时间使用氟胺烟酸甲基葡胺,目的是增加可移植胚胎的回收率。其它防止黄体早期退化的方法是避免利用马绒毛膜促性腺激素进行超排(Armstrong and Evans, 1983),以及利用绒毛膜促性腺激素/GnRH进行排卵处理3~4天,目的是中和大卵泡的负效应(Saharrea et al.,1998)。
        4 腹腔镜活体采卵及胚胎的体外生产
        利用腹腔镜采集未成熟卵母细胞进行胚胎的体外生产就能够克服与标准MOET技术有关的一些问题。这种方法可以多次使用,因为它的创伤小于采集子宫阶段胚胎的手术方法。此外,这种方法还可以避免造成超排不良后果的一些因素,如像排卵率低、黄体早期退化和受精率低等。这种方法的可靠性和可重复性都较好。对促性腺激素的响应存在个体变异,而活体采卵方法对每个供体几乎都能抽吸出5个以上的卵母细胞。这种方法能够从不能利用人工授精或MOET进行繁殖的个体,如从未性成熟个体获得后代。活体采卵还能很好地为DNA显微注射(产生转基因个体)或核转移的胞质受体提供合子。
    Snyder and Dukelow在1974年首次进行了活体采卵,他们利用腹腔镜从绵羊的21个卵泡抽吸到6个卵母细胞。但是在发展出胚胎的体外生产技术之前,并没有充分认识到活体采卵技术的巨大潜力。
        活体采卵的方法简介如下:供体山羊被控制在标准的腹腔镜台上,给予全麻。利用一根通过塑料管与采集管相连的针和真空管,在腹腔镜的观察下对卵泡进行抽吸。当有经验的操作者进行抽吸时,根据被抽吸的卵泡数量,每只母羊的操作时间为10~20分钟,在2~3小时内可采集100枚以上的卵母细胞。
        为了采集到优级的卵母细胞,需要用促性腺激素对供体母山羊进行同期发情处理。通常是在腹腔镜活体采卵前10天,将含有60毫克甲孕酮的阴道海绵栓插入阴道,在插入第八天的早晨给予125微克的Es?鄄trumate (加拿大)。对山羊和绵羊均有人作过不同激素的试验。其中包括多次注射FSH的方法和一次使用FSH+eCG的方法(腹腔镜活体采卵前36小时)。H. Baldassarre等人采用一次使用FSH+eCG的方法,在4年中实施腹腔镜活体采卵1580次,共采集卵母细胞21219枚,平均每只母山羊13.4枚,平均采卵率约为80%。
        腹腔镜活体采出的卵母细胞在体外成熟和体外受精简介如下:体外成熟是在含有TCM199的50微升悬滴中加入10%休情期山羊血清,并在含有5%二氧化碳、温度为39度的恒温恒湿孵化箱中培养24~27小时,体外受精是在含有TALP的50微升悬滴中加入20%休情期山羊血清,并在含有5%二氧化碳、温度为39度的恒温恒湿孵化箱中进行受精。授精的新鲜精液浓度为每毫升含1X106精子。两种配子在箱中共同培养15~20小时。所产生的受精卵或者用于移植到同期受体羊的输卵管,或者进一步培养到发育的子宫阶段。H. Baldassarre等人将体外受精24小时内的胚胎移植到受体羊,出生的山羊羔数占卵母细胞的比例为10%~20%。
        腹腔镜活体采卵及胚胎体外生产技术在商业上的重要价值在于使高遗传价值山羊在性成熟之前就能产生很多的后代,也就是所谓的母羔体外胚胎生产技术。这种技术能够缩短世代间隔,并且用促性腺激素处理母羔后的卵泡响应特别显著。采用前述的一次性处理方法,不需要进行同期发情处理,母羔所采集的卵母细胞几乎是成年母羊的两倍。
        值得注意的是,这种技术运用于100日龄母羔的情况下,当它产生的后代出生时,这些供体母羔才达到正常的繁殖年龄。因而JIVET技术是腹腔镜活体采卵及体外胚胎生产的最为有效的运用,因为这种技术能够缩短世代间隔,加快遗传进展,产生大量的高价值后代。
        5 转基因的克隆技术
        山羊是生产重组蛋白特别有效的动物,因为山羊的产奶量不低,投入和维持成本相对于奶牛较低。奶山羊的产奶量一般为600~800公斤。因而药用蛋白的产量也不低。如100只转基因山羊可生产100公斤单克隆抗体,75只转基因山羊可生产75公斤ATⅢ(抗凝血酶)。其次,如果采用显微注射的方法生产药用蛋白,奶山羊从最初的显微注射到开始含有药物蛋白的泌乳所需时间是16到18个月(妊娠+生长到性成熟+妊娠),而牛则需要大约3年。由此可见,山羊是生产重组蛋白特别有效的生物反应器。现在,转基因山羊已经能够生产大量的药用蛋白,也能够从奶中将其提纯和进行生物学测定。有几种产品已经进入临床试验,不久就可进入市场(Meade等人,1999)。例如,转基因山羊生产的ATⅢ已进入Ⅲ期临床试验,预计2004年可进入市场;转基因山羊生产的t-PA已进入Ⅱ/Ⅲ期临床试验,预计2006年可进入市场。
        产生转基因山羊的传统方法是将DNA结构显微注射到体内来源的前核期受精卵中(Ebert et al., 1991)。这种方法是可靠的,但是效率太低。因为这种随机整合造成了转基因结果的未知性(通常出生的转基因羔羊少于10%),以及表达的未知性(通常每升奶中的重组蛋白为0~10克)。原因是位置效应的作用,即染色体上各个基因不仅独立发生作用,相邻基因还能共同发生作用和相互影响(Wall等人,1996)。已有报导利用腹腔镜活体采卵,通过体外生产受精卵,再进行前核期显微注射来产生转基因羊(Baldassarre et al.,2003a)。这种方法增加了每只供体羊的采卵次数,能够较好地预知产生的胚胎(卵)数,能够控制对于成功整合起关键作用的受精时间和DNA显微注射时间。在出现第一只克隆绵羊之后(Wilmut et al., 1997),就有可能通过体细胞核转移来进一步提高产生转基因山羊的效率。这种方法可以将DNA结构掺入到靶细胞中,随后根据整合的情况选择用于转移的供体细胞。虽然核转移重组胚胎的繁殖效率大大低于传统的前核期显微注射方法(因为前一种方法的受胎率低和较高的死羔率),但是前一种方法所出生的羔羊都是转基因个体,它们几乎都能生产高价值的奶重组蛋白(Baldassarre et al., 2003b, 2004b; Wheeler et al., 2003)。
        转基因和体细胞核转移技术的运用能够使奶、肉和马海毛这样的经济性状改进,但尚未看到这方面的报导。除非是生产转基因羊和克隆羊的技术效率和成本有了非常大的改进,这种技术还不可能广泛用于山羊生产性能的提高。
        总的来说,同期发情和人工授精是山羊遗传改进中运用最为广泛的先进繁殖技术,这是由于它们的技术简单、成本相对较低,而效率却高。MOET的广泛运用还需要提高其重复性和降低它的生产成本。MOET将会继续运用于原种群的繁殖,特别是用于高遗传价值山羊的国际贸易。腹腔镜活体采卵和胚胎体外生产对于高价值山羊的繁殖可能更为有效,但是这种技术的利用受限于较之MOET需要更为苛求的实验室条件。腹腔镜活体采卵运用于高价值母羔的高效繁殖具有其特殊的意义。JIVET技术与进口贵重山羊冷冻胚胎结合起来,具有非常大的经济效益。在这种情况下,从冷冻胚胎出生的母羔在性成熟之前可以进行几次腹腔镜活体采卵,从而达到快速繁殖的目的。这对于新引进品种(品系)发展的早期阶段特别重要。奶、肉和马海毛这样的山羊生产性状的提高可能受益于转基因技术。但是,对于该技术广泛运用于提高这些生产性状的来说,还有待于识别出对特定性状产生影响的基因,并提高这种技术的效率,以及使达到和评估这种遗传进展的成本降低。克隆技术也能够提高转基因技术在上述运用中的效率。但是需要解决高成本、妊娠率低和成活率低的问题和缺乏遗传多样性的问题后,它才能作为家畜改良方法运用于生产。

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